DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA

IVD

Conserve a 2-8ºC

Principio del método

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada

SIGNIFICADO CLINICO

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a  la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos.  Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud1,5,6

.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS

HEMOGLOBIN 50x

Ferricianuro de potasio 0.60 mmol/L Cianuro de potasio 77  mmol/L Dihidrogeno fosfato de potasio 2 mmol/L

HEMOGLOBINA CAL

Patron de Hemoglobina g/dL  Ref.1001232 Origen animal

PRECAUCIONES

Cianuro de potasio: Nocivo (Xn): R26/27/28: Muy tóxico por inhalación,  por ingestión y en contacto con la piel. R32: En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Peligroso para le medio ambiente (N): R52/53: Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. S7: Manténgase el recipiente bien cerrado. S28: En contacto con la piel, lavar inmediatamente y abundantemente con agua. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al medico. S60: Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61: Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas/ las fichas de datos de seguridad. Cianuro (venenoso): La concentración de cianuro en el Reactivo concentrado (50x) es sensiblemente menor que la dosis mínima letal para el adulto. Su acidificación puede provocar liberación de ácido cianhídrico.

PREPARACIÓN

Reactivo de trabajo (RT):

- Para 5 mL 4,9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo

- Para 250 mL 245 mL agua destilada + 1 frasco (5 mL) de Reactivo

Mezclar bien.

Estabilidad: 2 meses en nevera a 2-8ºC, protegido de la luz.

CONSERVACION Y ESTABILIDAD

Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos:

- Presencia de partículas y turbidez.

- Absorbancia (A) del Blanco a 540 nm 0,01.

MATERIAL ADICIONAL

- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 540 nm.

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.

MUESTRAS

Sangre capilar o venosa1

Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.

Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8ºC.

Reactivos:

•   Reactivo Drabkin
• Ferrocianuro de potasio
• Cianuro de potasio
• Bicarbonato de potasio
• Solución estándar de cianometahemoglobina

Material y Equipo:

• Espectrofotómetro.
• Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.
• Pipeta semiautomática
• Tubos de ensayo.
• Cubetas cuadradas.
• Gradilla
• gasa

Procedmiento

1. En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P)
   
2. Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
   
3. Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.
4. Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipetacon papel .
   
   
   
5. La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
   
6. Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución
   
7. Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.
8. Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.
   
9. Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

MEDICION EN EL ESPECTROFOTOMETRO

1. Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
   
2. Presine < %T> para Transmitancia. Aparecerá en la pantalla “T”.
3. Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.
   
4. Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.
   
5. Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.
6. Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela).

A) METODO MACRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	5.0	5.0	5.0
Calibrador (uL)	--	20	--
Muestra (uL)	--	--	20

B) METODO MICRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	2.5	2.5	2.5
Calibrador (uL)	--	10	--
Muestra (uL)	--	--	10

• Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC).Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.

CALCULOS

- Con factor2: (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra

- Con Patrón:

(A)Patrón ÷ (A)Muestra x 15 (Conc. Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra

CONTROL DE CALIDAD

Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias.

VALORES DE REFERENCIA1

 Hombres 14 - 18 g/dL 8,7 - 11,2 mmol/L

 Mujeres 12 - 16 g/dL 7,5 - 9,9 mmol/L

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio  establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DEL METODO

Rango de medida: Desde el limite de detección de 0,1 g/dL hasta el limite de linealidad de 20 g/dL.

Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.

Precisión:

	Intraserie (n=20)
Media (g/dL)	8,00	15,2
SD	0,29	0,33
CV(%)	3,59	2,19

Interserie (n=20)
7,81	15,1
0,19	0,26
2,51	1,74

 

Sensibilidad analítica: 1 g/dL = 0,027 A.

Exactitud: Los reactivos de SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales.Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.

Resultados

Calculo

Estandar= .340

Blanco= 100.0

M1=  .392

M2= .304

H. :.392/.340 x 15= 17.29 gr/dL

M. :.304/.340 x 15= 13.41 gr/dL

Conclusión

Esta práctica nos es útil para Poder determinar el volumen de Hb que hay en la sangre. Los exámenes de laboratorio pueden realizarse por muchas razones, como investigación rutinaria de salud o sospecha de enfermedad o de toxicidad. También pueden ser utilizados para determinar si la efectividad de un medicamento mejora o empeora. Los exámenes pueden medir el éxito o fracaso de un tratamiento. Pueden ser solicitados por razones médicas o legales.

Existen varios factores para determinar cuándo y con qué frecuencia se pueden realizar los exámenes. Su duración puede depender de los resultados o terminación de otros exámenes, procedimientos o tratamientos. Los exámenes pueden ser realizados inmediatamente en una emergencia o pueden ser demorados conforme una condición es tratada o monitoreada. Se puede sugerir un examen o llegar a ser necesario cuando aparecen ciertos signos o síntomas.

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