CONTEO DE LEUCOCITOS

Introducción:

El conteo de los elementos formes de la sangre es indispensable para la hematología diagnostico Para contar los leucocitos se diluye una cantidad exacta de sangre con el líquido Turk, que es una solución hipotónica que destruye a los eritrocitos y observa la estructura de los leucocitos, esta mezcla se coloca en una cámara de Neubauer y se cuenta el número de células en los cuadros indicados.

Material y Reactivos

• Pipeta de toma para globulos blancos
• Una cámara de Neubauer
• Un microscopio
• Gasas
• Sangre venosa con EDTA

PROCEDIMIENTO

1. Obtener sangre venosa con EDTA y mezclar perfectamente.
   
2. Aspirar sangre con la pipeta de Thoma hasta la marca 0.5.
   
3. Limpiar la parte externa de la pipeta con gasa o papel absorbente.
   
4. Aspirar liquido de Thurk hasta la marca 11.
   
5. Retirar la boquilla de la pipeta y sellar los extremos con papel parafilm.
   
6. Agitar la pipeta de Thoma de 3 a 5 min. y preparar la cámara con el cubrehematimetro.
   
7. Descartar las primeras 3 gotas y llenar la cámara por capilaridad por uno de los bordes del cubrehematímetro, sin que se formen burbujas o sobrepasen los canales de la cámara.
   
8. Dejar reposar de 3 a 5 min. la cámara con la muestra.
   
9. Enfocar la cámara en 1 microscopio y contar los leucocitos con el objetivo seco débil en 64 cuadros de las 4 cuadriculas de los extremos.
   
10. Multiplicar el número de leucocitos contados por 50
    

                   

RESULTADOS

Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos,  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3

Después de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente cálculo:

N° de leucocitos x mm3 = altura x dilución x área 

N° de leucocitos x mm3 = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000

N° de leucocitos x mm3 = 4/200 = 1/50

N° de leucocitos x mm3 = N° de leucocitos contados x 50

Resultado

El número de leucocitos fue de 178, que al multiplicarse por 50 daba como resultado 8900/mm3, lo que indica un índice normal, pues el paciente era mujer, de 17 años de edad.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..5 000-10 000

Valores de referencia:

Leucocitos:

• Adultos: 5000 - 10 000 / mm3
• Recién nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3
• Niños: 8000 - 15 000

Conclusión  

La modificación del porcentaje de leucocitos puede orientar al diagnóstico de enfermedades infecciosas, inflamatorias, y otros procesos.

Cuando en la medición de leucocitos se ven células jóvenes aparecen los neutrófilos en forma de núcleo en forma de bastón (cayados), y un aumento del porcentaje de los glóbulos blancos polimorfonucleares. Esto se denomina como "desviación a la izquierda". Este término sugiere infecciones bacterianas agudas.

La eosinofília, que es el aumento del porcentaje o del número total de eosinófilos, sugiere un cuadro alérgico o una infección parasitaria.

El recuento de leucocitos se realiza habitualmente en un estudio de hematimetría y recuento leucocitario completo.

RETICULOCITOS

OBJETIVO: Que el alumno aprenda a identificar y cuantificar correctamente a los retículocitos.

INTRODUCCIÓN: Los retículocitos son eritrocitos jóvenes y contienen en su interior RNA- ribosomal el cual puede observarse en forma de red (de ahí su nombre) mediante un colorante supravital. Cuando en la médula osea aumenta la eritropoyesis, aumenta también el número de reticulocitos que salen hacia la circulación.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO:

• Sangre venosa con EDTA
• Colorante de azul de cresil brillante o nuevo azul de metileno 
• Tubos de ensaye
• Portaobjetos
• Pipetas pasteur tallo corto con bulbo
• Baño maría
• Microscopio
• Aceite de inmersión
  
  

PROCEDIMIENTO

1. Mezclar la muestra sanguínea y en un tubo de ensaye colocar 5 gotas con una pipeta Pasteur
   
2. Agregarle 5 gotas del colorante con una pipeta Pasteur y mezclar
   
3. Incubar el tubo de ensaye a 37°C durante 15 min en el baño maría
   
4. Mezclar la suspensión y realizar un frotis en portaobjetos
   
5. Dejarlo secar a temperatura ambiente, agregarle una gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo 100x. 
   
6. Buscar células que presenten una red con coloración azul (reticulocitos). contar 1000 eritrocitos en diferentes partes del frotis e ir registrando el número de reticulocitos observados.
   

RESULTADO:

Numero de reticulocitos observados x 100/ número total de eritrocitos

VALORES DE REFERENCIA

ADULTOS: 0.5-2.0%

RECIEN NACIDOS: 2.5-6.5%

RESULTADO: 

18 X 100/ 1000 = 1.8%, el paciente está dentro de los valores normales en adultos. por lo tanto son correctos los cálculos 

Observaciones:

Los reticulocitos se pueden observan como hematíes con granulaciones o filamentos, de color azul oscuro. También podemos observar con esta tinción cuerpos de Heinz, que son alteraciones en las cadenas de hemoglobina o déficit de alguna enzima eritrocitaria, dan lugar a la hemoglobina inestable que se desnaturaliza con facilidad dando lugar a precipitado dentro del hematíe.

Indices Eritrocitarios

INTRODUCCIÓN 

Los índices eritrocitarios también se denominan como índices hematimétricos o índices corpusculares. Son una serie de parámetros que expresan diferentes características de los hematíes. Los tradicionales se calculan a partir de los valores obtenidos, previamente, del número de hematíes (en millones por mm3), del hematocrito (en %) y de la concentración de hemoglobina en la sangre (en g/dl).Los auto analizadores hematológicos son capaces de proporcionar los índices tradicionales, y además, suministran otros nuevos.

Prestan una ayuda eficaz para diferenciar las anemias y da una mejor visión de la morfología del glóbulo rojo y se clasifican en:

VCC Nos da una idea del volumen corpuscular medio de los hematíes. Nos permite saber si son:

• Normocíticos: tamaño normal
• Macrocíticos: tamaño grande
• Microcíticos: tamaño pequeño

Fórmula:   (Hematocrito) x (10) / (Nº hematíes/L)

Valores normales: 82-92 M3

CHCM (Concentración corpuscular media de hemoglobina)

Expresa el promedio de la concentración hemoglobina del hematíe.

Da la relación entre el peso de la Hgb y el volumen del hematíe.

Fórmula: (Hb) x (10) / (hematocrito)  %

Valores normales: 32-36%

 Nos indica si los hematíes son:

• Normocrómicos: normalmente cargados de Hgb
• Hipocrómicos: poco cargados de Hgb
• Hipercrómicos: muy cargados de Hgb

HCM (Hemoglobina corpuscular media)

Expresa el peso medio de Hgb en el hematíe. Su resultado estará en relación con el VCM y MCHC.

Fórmula: (Hgb) x (10) / (Nº hematíes/l).      

Valores normales: 27-31 microgramos.

Indices Eritrocitarios
(valores absolutos)

1.  V.C.C  en M3  (82-92)
2. H.C.M en pg (29-32)
3. C.H.C.M   en % (32-36)

valores

Eritrocitos: 5810000

Hemoglobina: 17.4 g/dl  (Estándar) 

Hematocrito:  53

RESULTADOS

1. V.C..M  (53 % ) (10) /5810000 = 91.2 M3
2. M.C.M (17.4 g/dl) (10) / 5810000=  29.9 pg
3. C.H.C.M (17.4 g/dl) (10) / 53= 32.8 %

HEMATOCRITO

INTRODUCCIÓN

El hematocrito es el volumen que ocupan los eritrocitos en una muestra sanguínea y se expresa en porcentaje.

La determinación de hematocrito es un método sencillo y confiable para detectar anemia o policitemia.

El hematocrito se puede detectar mediante dos métodos:

1. MACROMETODO (WINTROBE)
2. MICROMETODO

OBJETIVO

Aprender a realizar la prueba del hematocrito utilizando el macro y micrométodo, conocer su importancia en el diagnóstico de enfermedades y la forma adecuada de su procedimiento.

MATERIAL Y REACTIVOS

• Tubo de wintrobe         Sangre venosa
• Tubo capilar
• Plastilina
• Centrifuga
• Microcentrifuga
• Pipeta Pasteur de tallo largo
• Equipo para venopuncion
• Lector para hematocrito o regla

TECNICA (MACROMETODO)

1. Mezclar la muestra sanguínea suavemente y con una pipeta pasteur o cánula llenar el tubo de wintrobe, colocando la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo, la punta de la pipeta se va elevando pero permaneciendo por debajo del menisco de sangre para evitar la formación de burbujas o espuma.
   
2. El tubo se llena hasta la marca 100 con la muestra sanguínea y se pone a centrifugar durante 30 minutos a 3,000 r.p.m.
   
   
3. Se efectúa la lectura.
   

Lectura:

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de glóbulos rojos.

Valores de referencia:

Hombres: 47% - 50%

Mujeres: 42% - 50%

TÉCNICA (MICROMETODO)

1. Mezclar la muestra sanguínea adecuadamente y llenar un tubo capilar hasta 3/4 partes.
   
2. El extremo vació que no estuvo en contacto con la sangre se sella con plastilina o calor.
   
3. El tubo con la muestra sanguínea se coloca en la microcentrifuga a 10,000 r.p.m. durante 10 minutos.
   
4. Leer el porcentaje de hematocrito en el lector o medirlo con la regla.
   

Se considera a la medida total de eritrocitos, leucocitos y plasma en mm como un 100% y con la medida de solo los eritrocitos tambien en mm se obtiene su porcentaje con respecto a este por medio de una regla de tres:

Medida total= 58 mm (eritrocitos, leucocitos y plasma)

Medida de eritrocitos= ¿? mm

Resultados 

Macrometodo:

En el tubo de Wintrobe se mide directamente el nivel de la columna de glóbulos rojos, comparando el número de la lectura con los siguientes porcentajes:

Hombres: 47.0 ±5.0%

Mujeres: 42.0 ±5.0%

Niños (5 años) 38%-44%

La sangre de la paciente en este caso era de una mujer, y nos dio  como resultado hasta la marca 4.7 de eritrocitos, estando en un rango normal.

MICROMETODO: 47%

Micrometodo

Se considera a la medida total de eritrocitos, leucocitos y plasma en mm como un 100% y con la medida de solo los eritrocitos tambien en mm se obtiene su porcentaje con respecto a este por medio de una regla de tres:

Medida total= 58 mm (eritrocitos, leucocitos y plasma)

Medida de eritrocitos= 29 mm

58 mm -------------------------- 100%

29 mm ------------- x (hematocrito)

HEMATOCRITO: 50 %

Conclusión:

El hematocrito es la medición del volumen de glóbulos rojos en la sangre en porcentaje y mediante la centrifugación separamos en tres niveles que son los eritrocitos, plaqueta y leucocitos y hasta arriba el plasma, este examen nos sirve principalmente para diagnosticar algunas enfermedades como pueden ser anemias, leucemias o policitemias

 Si los niveles son bajos pueden deberse a:

• Anemia
• Sangrado
• Destrucción de los glóbulos rojos
• Leucemia
• Desnutrición
• Sobre-hidratación

 Si los niveles son altos puede deberse a:

• Cardiopatía congénita
• Deshidratación
• Eritrocitosis
• Niveles bajos de oxigeno en la sangre
• Fibrosis pulmonar
• Policitemia

 La técnica más fácil de realizar fue la de macro hematocrito con el tubo de wintrobe ya que es más fácil dar un resultado aunque ambas técnicas son efectivas pero en la de microhematocirto se puede hacer con dos muestras diferentes ya sea capilarmente o con la venopunción

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HEMOGLOBINA

IVD

Conserve a 2-8ºC

Principio del método

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada

SIGNIFICADO CLINICO

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a  la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos.  Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud1,5,6

.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS

HEMOGLOBIN 50x

Ferricianuro de potasio 0.60 mmol/L Cianuro de potasio 77  mmol/L Dihidrogeno fosfato de potasio 2 mmol/L

HEMOGLOBINA CAL

Patron de Hemoglobina g/dL  Ref.1001232 Origen animal

PRECAUCIONES

Cianuro de potasio: Nocivo (Xn): R26/27/28: Muy tóxico por inhalación,  por ingestión y en contacto con la piel. R32: En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Peligroso para le medio ambiente (N): R52/53: Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. S7: Manténgase el recipiente bien cerrado. S28: En contacto con la piel, lavar inmediatamente y abundantemente con agua. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al medico. S60: Elimínese el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61: Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas/ las fichas de datos de seguridad. Cianuro (venenoso): La concentración de cianuro en el Reactivo concentrado (50x) es sensiblemente menor que la dosis mínima letal para el adulto. Su acidificación puede provocar liberación de ácido cianhídrico.

PREPARACIÓN

Reactivo de trabajo (RT):

- Para 5 mL 4,9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo

- Para 250 mL 245 mL agua destilada + 1 frasco (5 mL) de Reactivo

Mezclar bien.

Estabilidad: 2 meses en nevera a 2-8ºC, protegido de la luz.

CONSERVACION Y ESTABILIDAD

Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos:

- Presencia de partículas y turbidez.

- Absorbancia (A) del Blanco a 540 nm 0,01.

MATERIAL ADICIONAL

- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 540 nm.

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.

MUESTRAS

Sangre capilar o venosa1

Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.

Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8ºC.

Reactivos:

•   Reactivo Drabkin
• Ferrocianuro de potasio
• Cianuro de potasio
• Bicarbonato de potasio
• Solución estándar de cianometahemoglobina

Material y Equipo:

• Espectrofotómetro.
• Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.
• Pipeta semiautomática
• Tubos de ensayo.
• Cubetas cuadradas.
• Gradilla
• gasa

Procedmiento

1. En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P)
   
2. Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
   
3. Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.
4. Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipetacon papel .
   
   
   
5. La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
   
6. Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución
   
7. Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.
8. Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.
   
9. Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

MEDICION EN EL ESPECTROFOTOMETRO

1. Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
   
2. Presine < %T> para Transmitancia. Aparecerá en la pantalla “T”.
3. Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.
   
4. Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.
   
5. Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.
6. Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela).

A) METODO MACRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	5.0	5.0	5.0
Calibrador (uL)	--	20	--
Muestra (uL)	--	--	20

B) METODO MICRO

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (mL)	2.5	2.5	2.5
Calibrador (uL)	--	10	--
Muestra (uL)	--	--	10

• Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25ºC).Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.

CALCULOS

- Con factor2: (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra

- Con Patrón:

(A)Patrón ÷ (A)Muestra x 15 (Conc. Patrón) = g/dL de hemoglobina en la muestra

CONTROL DE CALIDAD

Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias.

VALORES DE REFERENCIA1

 Hombres 14 - 18 g/dL 8,7 - 11,2 mmol/L

 Mujeres 12 - 16 g/dL 7,5 - 9,9 mmol/L

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio  establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DEL METODO

Rango de medida: Desde el limite de detección de 0,1 g/dL hasta el limite de linealidad de 20 g/dL.

Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.

Precisión:

	Intraserie (n=20)
Media (g/dL)	8,00	15,2
SD	0,29	0,33
CV(%)	3,59	2,19

Interserie (n=20)
7,81	15,1
0,19	0,26
2,51	1,74

 

Sensibilidad analítica: 1 g/dL = 0,027 A.

Exactitud: Los reactivos de SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales.Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.

Resultados

Calculo

Estandar= .340

Blanco= 100.0

M1=  .392

M2= .304

H. :.392/.340 x 15= 17.29 gr/dL

M. :.304/.340 x 15= 13.41 gr/dL

Conclusión

Esta práctica nos es útil para Poder determinar el volumen de Hb que hay en la sangre. Los exámenes de laboratorio pueden realizarse por muchas razones, como investigación rutinaria de salud o sospecha de enfermedad o de toxicidad. También pueden ser utilizados para determinar si la efectividad de un medicamento mejora o empeora. Los exámenes pueden medir el éxito o fracaso de un tratamiento. Pueden ser solicitados por razones médicas o legales.

Existen varios factores para determinar cuándo y con qué frecuencia se pueden realizar los exámenes. Su duración puede depender de los resultados o terminación de otros exámenes, procedimientos o tratamientos. Los exámenes pueden ser realizados inmediatamente en una emergencia o pueden ser demorados conforme una condición es tratada o monitoreada. Se puede sugerir un examen o llegar a ser necesario cuando aparecen ciertos signos o síntomas.

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